細胞增殖是生物體的重要生命特征。研究細胞增殖，對於理解細胞發育和分化，探索疾病的發病機制和臨床治療方法的安全性評估等都有著重要的意義。傳統的測定細胞增殖的方法主要有MTT/CCK8比色法，Brdu法，3H-TdR同位素摻入法。其不足之處分別在於：比色法隻能在總體水平上提供細胞數總量變化的信息，不能在單個細胞水平上分析細胞增殖信息；Brdu法隻能檢測處於S期的細胞，僅能反應細胞增殖率，適用於短期檢測；而同位素法則存在放射性污染。
CFSE染色方法和數據分析方法與傳統方法相比具有很大的優勢，能與流式細胞染色技術相結合，在單個細胞水平上檢測細胞增殖，且能夠動態的分析細胞增殖。且對CFSE數據分析方面，Flowjo等流式分析軟件，都有現成的增殖擬合算，可以得到相對定量的分析結果，就更有助於人們瞭解細胞存活或死亡的機制。
一、原理介紹：
CFSE可自由穿透細胞膜，且一旦進入細胞後不能從細胞中釋出，在活細胞內與胞內蛋白進行不可逆的結合，並在細胞內被酯酶水解後釋放出綠色熒光，在細胞分裂增殖過程中，它的熒光會平均分配至兩個子代細胞中，從而導致熒光強度隨著細胞的分裂而逐級遞減，根據這一特性，它可被用於檢測細胞增殖。
另外，CFSE標記的細胞用於體內觀察熒光可保存長達數周之久，它常被用來做活體細胞追蹤檢測實驗和用熒光電鏡觀察細胞長期活動的實驗,為細胞免疫和細胞生物學研究開辟瞭一條新的有效途徑。
二、CFSE母液制備：
CFSE一般購買到的產品為幹燥粉末，使用DMSO進行溶解，母液終濃度一般為5 or 10 mM，因粉末體積也需計算在內，請嚴格按照說明書推薦進行操作。
註：染料粉末可在≤-20°C避光長期保存直至使用。用DMSO溶解後，建議分裝保存避免反復凍融，嚴格按照儲存說明儲備溶液在≤-20°C可穩定3個月。CFSE的長期存放會使CFSE的標記率隨時間延長而下降。
三、染色體系：
①染色基本流程：
DPBS洗滌離心收集細胞→DPBS重懸→加CFSE染色→37℃孵育→DPBS洗滌離心收集細胞→含10%FBS的培養基洗滌離心收集細胞→重懸於完全培養基→37℃培養→取細胞洗滌進行後續常規流式染色或直接重懸上機
②染色緩沖液：
使用DPBS是為避免染色環境中存在的疊氮化物、血清或蛋白質結合遊離CFSE染料幹擾細胞染色，相對PBS效果更佳，千萬不可直接在培養基中進行染色孵育。
③細胞染色濃度：
常見的細胞孵育濃度一般在0.5~50×10^6 /ml，但這個細胞濃度范圍較廣，建議按如下操作進行：
A.對於低濃度的細胞（＜10×10^6 /ml），須在添加蛋白質的情況下標記細胞以緩沖CFSE的毒性作用，CFSE 可能不會誘導細胞死亡，但會抑制正常的細胞分裂。建議在含有 5% (v/v) FBS 的DPBS/PBS中染色。
B.對於高濃度的細胞（10~50×10^6 /ml），蛋白質或培養基成分會降低 CFSE標記的程度。建議在不含蛋白質的DPBS/PBS中染色。
④CFSE濃度：
CFSE初始濃度過高會導致細胞死亡或抑制細胞增殖，過少又會影響標記效率。常用濃度為0.5~5 μM，具體的使用濃度與細胞的抗性和細胞的初始密度也密切相關，各位老師一定要做好充分的預實驗。
⑤CFSE染色時間：
CFSE的初始濃度在合適范圍內時，染色時間對細胞活性和增殖都基本沒有影響，但若CFSE濃度高瞭，細胞的增殖水平則會隨著染色的時間增加而降低，一般建議3~5 min相對較佳。
四、細胞體外培養時間：
建議原代細胞培養時間一般在48~96 h，48 h後增殖峰開始相對明顯，易於組間比較分析，另CFSE會隨細胞增殖分裂熒光亮度逐漸減弱，8-9代增殖後基本已無法檢出，因此建議不要超過96 h。
五、數據分析：
①Flowjo結果分析：
Flowjo軟件上有增殖數據擬合的功能，大傢可以關註B站up主“半瓶流式小美膩”，參照線上視頻指導進行操作：https://www.bilibili.com/video/BV1nf4y1T7w4?spm_id_from=333.337.search-card.all.click
②結果圖說明：
增殖結果中圖片從右至左看，結合未培養的對照管對比，最右側的峰為初代峰，五指峰分群明顯的，可如下左圖根據峰值和擬合結果判斷分裂代數及每一代的細胞數進行組間的對比。五指峰分群不明顯的，或組間差異顯著的，也可按照如下右圖直接圈取所有處於增殖中的細胞群體，進行組間對比。
③增殖峰的CV值說明：
細胞分裂往往會表現出介導信號傳導和細胞命運決定的蛋白質分配不均的細胞異質性。因此培養中的原代細胞，若細胞亞群種類多的，會使細胞的標記率發生差異，表現出相對稍大的CV值（如PBMC，原代T細胞等），其增殖代數依然可依據增殖峰數量進行判斷。而隨著子細胞之間異質性的加劇使分配不對稱程度嚴重增加（如腫瘤細胞等），會導致世代簇的峰值分辨率較差，無法根據傳統擬合手法計算增殖代數，建議直接使用增殖區間的細胞所占總細胞數的百分比進行組間比較。
六、其他註意事項：
①對照設置：
a、未培養但染色的對照細胞，用於確認細胞的初始標記的亮度。
b、培養但未染色的對照細胞，用於確認陰陽性信號及細胞的自發熒光。
②細胞培養過程中很多外界因素都會導致細胞生長狀態下降，檢疫結合染死活染料，排除死細胞幹擾。
參考文獻
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