藥物分離純化用柱層析矽膠應用與綜述

柱層析矽膠主要成分是介孔二氧化矽，二氧化矽的化學分子式為mSiO2 ．nH2O，不溶於水和任何溶劑，無毒無味，化學性質穩定，除強堿、氫氟酸外不與其他物質發生反應。獨特的介孔結構能特異性的吸附不同分子量、極性官能團的物質，廣泛應用於各種原料藥、半合成/合成中間體的分離純化；本文從柱層析矽膠分離純化原理、柱層析固定相矽膠和流動相溶劑的選擇、柱層析使用註意事項、柱層析矽膠展望幾個方面進行瞭論述。

關鍵詞：柱層析、矽膠、原料藥、分離純化

一、柱層析矽膠分離純化原理

介孔二氧化矽除具有大的比表面積和介孔結構外，其比表面上含有大量的矽羥基和矽氧烷基，矽羥基的矽氧烷基能特異性的吸附不同極性的物質和官能團，因而矽膠層析法的分離原理是根據物質在矽膠介孔內吸附解吸附的強弱不同而得到分離，不同極性強弱的物質在柱層析矽膠上的保留時間不同能分段洗脫出從而達到分離除雜純化的目的；一般情況下極性較大的物質易被矽膠吸附，極性較弱的物質不易被矽膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。

二、柱層析固定相矽膠和流動相溶劑的選擇

1、柱層析固定相矽膠的選擇

1.1柱層析矽膠的規格

1.1.1根據行業標準HGT 2354-2010，柱層析矽膠有以下規格：

1.1.2根據介孔大小分類：

大孔（孔容＞1.0）層析矽膠、粗孔（C型）層析矽膠、中孔（B型）層析矽膠、細孔（A型）層析矽膠

1.1.3根據粒度大小分類：

60-100目、80-120目、100-200目、150-230目、200-300目、200-350目、300-400目、400-600目、＞600目等

表2-目數粒度對應表

1.2柱層析矽膠的主要指標與分離純化的關系

1.2.1孔容孔徑：

矽膠的孔容積、孔徑與分離純化物的分子量有直接對應關系，一般來說A/B型層析矽膠應用在分子量≤500物質的分離純化上，C型層析矽膠分離分子量500-2000的物質，大孔層析矽膠分離分子量2000-40000的物質，特大孔層析矽膠分離分子量＞40000的物質；

1.2.2比表面積：

層析矽膠的比表面積與分離純化的柱效有關，層析矽膠大的比表面積提供目標物雜質和矽膠吸附解吸附過程的場所，用於物質的分離純化，一定范圍指標內來說比表面積越大層析矽膠的柱效越高；

1.2.3粒度/粒度合格率：

層析矽膠的粒度與與分離純化的柱效和柱壓有關，一般來說粒度越小柱效越高，相應的柱壓越大，若粒度與柱壓不匹配則影響流速從而影響分離效率和分離效果；

對於中低壓柱來說，層析矽膠填料粒度≤400目，400-3000目則應用在高壓柱上，柱壓、分離效果等也與填料的形狀有關，球型比無定型在適用性和分離效果上都具有一定優勢。

粒度合格率影響填料的分佈均勻性，從而影響分離純化過程，合適的粒度分佈可以使過柱和洗脫過程均勻，避免分離過程中色帶傾斜或過寬的發生。

1.2.4加熱減量:

加熱減量也就是層析矽膠的水分含量，水分含量的多少影響層析矽膠的極性，從而影響層析分離，水的極性強過高的水分含量會導致層析矽膠失去分離效果，層析矽膠原料加熱減量控制一般≤5%，成品層析矽膠加熱減量要根據實際需求進行活化處理；

1.2.5層析矽膠pH值：

層析矽膠pH：細孔規格層析矽膠pH4-6、B型規格層析矽膠pH5-7、C型規格層析矽膠pH6-8，pH＞8的堿性條件下層析矽膠不能進行有效的分離純化，因而分離純化堿性物質或者堿性條件下的柱填料一般不用層析矽膠；

1.2.6雜質含量：

層析矽膠雜質主要是無機鹽金屬離子，其中Na、Ca、Mg、Fe離子及其氧化物占比90%以上，金屬離子的存在會影響分離物的分離效果和成品的純度，因而在有純度要求的產品分離中一般會選用精制型的層析矽膠，或者純度更高的高純層析矽膠；

2、流動相溶劑

流動相溶劑是將被分離物從吸附劑上洗脫下來所用的溶劑，所以也稱為洗脫劑或簡稱溶劑。2.1常用溶劑的極性順序：

水>甲酰胺>三氟乙酸>DMSO>乙腈>DMF>六甲基磷酰胺>甲醇>乙醇>乙酸>異丙醇>吡啶>四甲基乙二胺>丙酮>三乙胺>正丁醇>二氧六環>四氫呋喃>甲酸甲酯>三丁胺>甲乙酮>氯仿>乙酸乙酯>三辛胺>碳酸二甲酯>乙醚> 異丙醚>正丁醚>三氯乙烯>二苯醚>二氯甲烷>二氯乙烷>苯>甲苯>四氯化碳>二硫化碳>環己烷>己烷>煤油（石油醚）

2.2選取溶劑的要求

2.2.1在常溫至沸點的溫度范圍內可與被分離物長期共存不發生任何化學反應，也不被吸附劑或被分離物催化而發生自身的化學反應；

2.2.2沸點較低以利回收且便於純化除雜精制；

2.2.3毒性較小，操作安全；

2.2.4流動相溶劑使用量大，要考慮成本較低，來源方便；

2.2.5回收溶劑一般不應作為最終純化產物的流動相溶劑。

2.3溶劑對分離純化的影響

溶劑極性大小和對被分離物各組分的溶解度大小對於分離效果非常重要。如果流動相溶劑的極性遠大於被分離物的極性，則流動相溶劑將受到吸附劑的強烈吸附，從而將原來被吸附的待分離物“頂替”下來，隨多餘的流動相溶劑沖下而起不到分離作用；如果流動相溶劑的極性遠小於各組分的極性，則各組分被吸附劑強烈吸附而留在固定相中，不能隨流動相向下移動，也不能達到分離的目的。如果流動相溶劑對於被分離物各組分溶解度太大，被分離物將會過多、過快地溶解於其中並被迅速洗脫而不能很好地分離；如果溶解度太小，則會造成譜帶分散，甚至完全不能分開。

三、柱層析使用註意事項

1.柱層析的使用操作

1.1.裝柱：裝柱的方法分濕法和幹法兩種。 實驗室濕法裝柱時，將柱豎直固定在鐵支架上，關閉活塞，加入選定的流動相溶劑至柱容積的1/4 ，用一支幹凈的玻璃棒將少量玻璃毛(或脫脂棉)輕輕推入柱底狹窄部位，小心擠出其中的氣泡，但不要壓得太緊密，否則流動相溶劑將流出太慢或根本流不出來。將準備好的白沙加入柱中，在玻璃毛上均勻沉積成約5mm厚的一層。將需要量的吸附劑置燒杯中，加流動相溶劑浸潤，溶脹並調成糊狀。打開柱下活塞調節流出速度為每秒鐘1滴，將調好的吸附劑在攪拌下自柱頂緩緩註入柱中，同時用套有橡皮管的玻璃棒輕輕敲擊柱身，使吸附劑在流動相溶劑中均勻沉降，形成均勻緊密的吸附劑柱。吸附劑最好一次加完。若分數次加，則會沉積為數層，全部吸附劑加完後，在吸附劑沉積面上蓋一層白沙(如柱很小，也可不用白沙而蓋上一張直徑與柱內徑相當的濾紙片)，關閉活塞。在全部裝柱過程及裝完柱後，都需始終保持吸附劑上面有一段液柱，否則將會有空氣進入吸附劑，在其中形成氣泡而影響分離效果。如果發現柱中已經形成瞭氣泡，應設法排除，若不能排除，則應倒出重裝。

幹法裝柱時，先將柱豎直固定在鐵支架上，關閉活塞。加入溶劑至柱容積的3/4，打開活塞控制溶劑流速為1滴/秒，然後將所需量的吸附劑通過一支短頸玻璃漏鬥慢慢加入柱中，同時，輕輕敲柱身使柱填充緊密。幹法裝柱的缺點是容易使柱中混有氣泡。

1.2加樣：加樣也分幹法、濕法兩種。

濕法加樣是將待分離物溶於盡可能少的溶劑中，打開柱下活塞小心放出柱中液體至液面下降到濾紙片處，關閉活塞，將配好的溶液沿著柱內壁緩緩加入，開啟柱下活塞，放出液體至溶液液面降至濾紙片時，關閉活塞，用少許溶劑沖洗柱內壁(同樣不可擾動吸附劑)，再放出液體至液面降到濾紙處，再次沖洗柱內壁，直至柱壁和柱頂溶劑沒有顏色。加樣操作的關鍵是要避免樣品溶液被沖稀。

幹法加樣是將待分離樣品加少量低沸點溶劑溶解，再加入約5倍量吸附劑，拌和均勻後在通風櫥中蒸發至幹。揭去柱頂濾紙片，將吸附瞭樣品的吸附劑平攤在柱內吸附劑的頂端，在上面加蓋濾紙片或加蓋一層白沙。幹法加樣易於掌握，不會造成樣品溶液的沖稀，但不適合對熱敏感的化合物。

1.3淋洗和接收：

樣品加入後即可用大量流動相溶劑淋洗。隨著流動相向下移動，混合物逐漸分成若幹個不同的色帶，繼續淋洗，各色帶間距離拉開，最終被一個個淋洗下來。當第一色帶開始流出時，更換接收瓶，接收完畢再更換接受瓶，接受兩色帶間的空白帶，並依此法分別接收各個色帶。若後面的色帶下行太慢，可依次使用幾種極性逐漸增大的流動相溶劑來淋洗。

1.4分離收集物檢測：分離無色物質時需要檢測，實驗室一般檢測為顯色或采用HPLC等分析儀器直接檢測。

常用的辦法是等分接收，即事先準備十幾個甚至幾十個接收瓶，依次編出號碼，各接收相同體積的流出液，並各自在薄層板上點樣展開，然後在薄層板上顯色。具有相同Rｆ值的為同一組分，可以合並處理。也可能出現交叉帶，若交叉帶很少，可以棄之，若交叉帶較多，或樣品很貴重，可以將交叉部分再次作柱層析分離，直至完全分開。同理采用分析儀器檢測的直接對接收的流出液檢測即可。

2.柱層析使用註意事項

2.1要控制流動相溶劑流出的速度。若流速太快，樣品在柱中的吸附和溶解過程來不及達到平衡，影響分離效果。若流速太慢，分離時間會拖得太長。有時，樣品在柱中停留時間過長，可能促成某些成分發生變化，或流動相在柱中下行速度小於樣品的擴散速度，會造成色帶加寬、交合甚至根本不能分離。2.2以下現象會嚴重影響分離效果，必須盡力避免。2.2.1色帶過寬，界限不清:造成的原因可能是柱的直徑與高度比選擇不當，或吸附劑、流動相溶劑選擇不當，或樣品在柱中停留時間過長。但更常見的卻是在加樣時造成的。若在樣品溶液加進柱中後，沒有打開下部活塞放出流動相溶劑使樣品溶液降至濾紙片處，即急於加溶劑沖洗柱壁，造成樣品溶液大幅度稀釋，或過早加大量溶劑淋洗，必然會造成色帶過寬。所以溶樣時一定要使用盡可能少的溶劑，加樣時一定要避免樣品溶液的稀釋。2.2.2色帶傾斜：正常情況下柱中的色帶應是水平的，如圖1-a 所示。而傾斜的色帶如圖1-b所示，在前一個色帶尚未完全流出時，後面色帶的前沿已開始流出，所以不能接收到純粹的單一組分。造成色帶傾斜的原因是吸附劑的頂面裝得傾斜，或柱身安裝得不垂直。2.2.3氣泡：當柱內有氣泡時，大量流動相溶劑順氣泡外壁流下，在氣泡下方形成溝流，使後一色帶前沿的一部分突出伸入前一色帶(見圖1-c)，從而使兩色帶難於分離。所以在裝柱及淋洗過程中應始終保持吸附劑上面有一段液柱。

圖1- 層析柱中的色帶(虛線表示更換接收瓶處)

2.2.4柱頂面填裝不平:這時色帶前沿將沿低凹處向下延伸進入前面的色帶(見圖1-d)，這也是一種溝流。

2.2.5斷層和裂縫:當柱內某一區域內積有較多氣泡時，這些氣泡會合並起來在柱內形成斷層或裂縫。圖1-e表示瞭裂縫造成的溝流，而斷層相當於一個不平整的裝載面，它造成溝流的情況與圖d相似。

四、柱層析矽膠產品展望

1. 柱層析矽膠具有優良的穩定性能和可控的介孔結構，在原料藥有效成分提取、醫藥中間體、有機合成/半合成物、液晶聚體等的分離純化方面會有長足的發展。

2. 從填料使用角度來看柱層析矽膠在介孔、純度、物理等指標上還需要進一步開發，比如均勻的介孔結構、低雜質高純度的生產工藝、均一的粒度和形貌等；

3. 從分離柱效和分離純度提高上來看亞微米級和微米級的球型柱層析矽膠仍然具有很好的開發和應用前景；

4. 針對藥物的分離純化在柱層析矽膠填料、柱子的選型、柱分離過程的工藝條件、分離純化樣品的檢測分析方面還需要建立完整的分析改進數學模型以便能更好更有效的工藝提升和指導生產。

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