脊髓損傷（SCI）是一種嚴重的中樞神經系統疾病。脊髓損傷後，損傷部位的運動神經元大量丟失，同時星形膠質細胞反應性增生並形成致密的膠質瘢痕。調節膠質瘢痕的密度和補充損傷區域的運動神經元對於脊髓損傷修復至關重要。多嘧啶束結合蛋白（PTB）是一種參與神經發生的核糖核酸結合蛋白。有研究發現在帕金森病和衰老小鼠模型中，多嘧啶束結合蛋白敲低可補充大腦中的神經元，並逆轉小鼠的運動表型。抑制PTB的表達是治療由神經元丟失引起的各種疾病的有力策略，但PTB敲低在脊髓損傷修復中的作用尚未被探索。
南通大學陳罡團隊在《中國神經再生研究（英文版）》上發表論文《Knockdown of polypyrimidine tract binding protein facilitates motor function recovery after spinal cord injury》利用病毒搭載的短發夾RNA（shRNAs）和反義寡核苷酸（ASOs）來敲低多嘧啶束結合蛋白的表達，以確定其在小鼠脊髓反應性星形膠質細胞以及脊髓損傷小鼠模型中的作用。
1、ShPTB mediates direct conversion of reactive spinal astrocytes from mice into motoneuron-like cells in vitro / ShPTB介導小鼠反應性脊髓星形膠質細胞直接轉化為運動神經元樣細胞
作者探討瞭PTB沉默是否導致反應性小鼠脊髓星形膠質細胞在體外轉化為運動神經元。用含有GFAP啟動子的慢病毒載體轉導小鼠的反應性脊髓星形膠質細胞，以驅動針對小鼠Ptbp1的shRNA的表達。當該載體轉導星形膠質細胞2天後， shPTB顯著下調瞭PTB蛋白表達和Ptbp1mRNA表達。在重編程後2周，轉導 shPTB的細胞顯示出復雜的神經突生長，到4周時，這些細胞顯示出明顯的神經元形態，而轉導shCtrl的細胞顯示星形細胞樣的扁平和多邊形形態。轉導3周後， 約41%轉導shPTB的GFP陽性細胞顯示瞭神經元標記物MAP2陽性染色。在轉化後4周，GFP+ /MAP2+細胞的百分比約為58%，約12% GFP+細胞顯示出運動神經元標記物ChAT的表達。相比之下，轉導shCtrl慢病毒載體的細胞僅顯示出GFP的陽性染色。這些數據表明，反應性脊髓星形膠質細胞可以通過體外PTB沉默被重編程為運動神經元樣細胞。
2、PTB silencing replenishes motoneuron-like cells around the injured area after SCI / PTB沉默可補充脊髓損傷後損傷區域周圍的運動神經元樣細胞
為瞭確定在脊髓損傷小鼠模型中，PTB沉默是否能補充神經元，包括運動神經元，作者將AAV註射到損傷脊髓區域的斜對側。用GFAP啟動子來驅動shPTB的表達，註射AAV-shPTB後1周，大量GFP+細胞與GFAP+星形膠質細胞共定位，而很少與ChAT+運動神經元共定位，也沒有與FoxJ1+神經幹細胞共定位。註射11周後，在損傷區域周圍一些GFP+細胞與神經元標記物NeuN或MAP2共定位，約19% GFP+細胞表達瞭運動神經元特異性標記物ChAT。在同一時間點，註射AAV-shCtrl後，損傷區域周圍未檢測到GFP+神經元樣細胞和GFP+運動神經元樣細胞。與AAV-shCtrl組相比，AAV-shPTB組的NeuN+、MAP2+和ChAT+細胞數量更為豐富。綜上所述，這些結果表明，shPTB可以補充脊髓損傷後損傷區域周圍的運動神經元樣細胞。
3、PTB knockdown facilitates motor function restoration in SCI mice / 敲低PTB促進脊髓損傷小鼠運動功能恢復
為瞭確定PTB敲低是否能促進脊髓損傷小鼠的功能恢復，作者利用BMS評分和遊泳測試來評估運動功能恢復情況。誘導小鼠發生壓縮性脊髓損傷，損傷後1周原位註射AAV-shPTB或AAV-shCtrl。損傷後6-12周，BMS評分、遊泳測試和傾斜板試驗結果表明，在PTB基因敲除後，肌肉力量的恢復有所改善。冷刺激誘發痛測試或熱板試驗結果顯示，註射AAV-shPTB的小鼠與註射AAV-shCtrl的小鼠相比，其表現沒有任何改善。這些結果提示AAV-shPTB治療可改善脊髓損傷後的運動功能。
4、Conversion of spinal astrocytes into motoneuron-like cells in vitro after transfection with PTB-ASOs / 轉染PTB-ASOs後脊髓星形膠質細胞轉化為運動神經元樣細胞
如圖所示，與對照組相比，PTB-ASO轉染組在轉染後2天星形膠質細胞PTB蛋白和Ptbp1 mRNA的表達顯著降低。轉染後5周，通過免疫細胞化學方法評估瞭重編程細胞的形態、成熟神經元標記物MAP2以及運動神經元標記物ChAT的表達。結果表明，PTB-ASO可顯著誘導體外反應性脊髓星形膠質細胞轉化為運動神經元樣細胞。
5、PTB-ASOs reduce the density of glial scars and replenished motoneuronlike cells in SCI mice / PTB-ASOs降低脊髓損傷小鼠膠質瘢痕的密度，補充運動神經元樣細胞
作者通過對損傷脊髓的GFAP染色來驗證PTB ASOs對脊髓膠質瘢痕密度的影響。在脊髓損傷後12周，對照組註射ASO的小鼠表現出典型的神經膠質瘢痕形態和交錯的星形膠質細胞。與對照組相比，PTB ASO註射組小鼠膠質瘢痕來源的星形膠質細胞分佈松散，突起較少，膠質瘢痕密度降低。脊髓損傷後12周，與對照組相比，PTB-ASO註射組小鼠病變區域近端區域NeuN+和ChAT+細胞數量更多。TUNEL染色和定量RT-PCR結果表明，PTB-ASO在不破壞其整體結構的情況下適度降低瞭脊髓損傷區域膠質瘢痕密度，補充瞭周圍運動神經元樣細胞，減少瞭脊髓損傷區域的細胞凋亡。
6、PTB-ASOs promote motor function recovery in SCI mice / PTB-ASOs可以促進脊髓損傷小鼠運動功能恢復
通過對脊髓損傷小鼠的行為學測試，進一步評估瞭PTB-ASO的功能。BMS評分、遊泳測試和傾斜板試驗結果顯示，與對照ASO處理組相比，PTB-ASO處理組小鼠脊髓損傷後5-12周運動功能得到瞭改善。損傷後12周，與對照組相比，PTB-ASO處理組小鼠傾向於使用下肢，並在脊髓損傷後表現出更強的肌肉力量。損傷後6-12周，PTB-ASO處理和對照ASO處理小鼠冷和熱誘導的感覺反應沒有差異。這些結果表明PTB-ASOs促進脊髓損傷模型小鼠的運動功能恢復。
綜上所述，在壓迫性脊髓損傷小鼠模型中，腺相關病毒短發夾RNA敲低多嘧啶束結合蛋白可增加損傷區域附近的運動神經元樣細胞數量，還能促進小鼠運動功能的恢復；而反義寡核苷酸敲低多嘧啶束結合蛋白的表達，不僅可以改善脊髓損傷小鼠的運動功能恢復，補充損傷區域周圍的運動神經元樣細胞，而且在不破壞其整體結構的情況下適度降低膠質瘢痕的密度。這一結果預示著多嘧啶束結合蛋白敲低可能是一種有效治療脊髓損傷的策略。
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